Metoder til kemisk syntese af peptider omfatter opløsnings--fase-peptidsyntese og fast---fase-peptidsyntese. Opløsnings-fase peptidsyntese involverer kobling af aminosyrer i opløsning; det forløber typisk i en C-terminal til N-terminal retning og er egnet til syntese af korte peptider (f.eks. dem, der indeholder færre end 10 aminosyrer). De almindeligt anvendte beskyttelsesstrategier omfatter BOC (tert{10}}butyloxycarbonyl) og Z (benzyloxycarbonyl) metoderne. Denne tilgang giver fordele såsom lavere omkostninger og let skalering-, selvom det nødvendiggør oprensning af mellemprodukter. De anvendte primære koblingsreagenser er af carbodiimidtypen (f.eks. DCC); disse kan dog fremkalde racemiseringsbireaktioner, som kan undertrykkes gennem tilsætning af additiver såsom HOBt.
Det grundlæggende princip for fast-fase peptidsyntese involverer immobilisering af den C-terminale aminosyre i peptidkæden på et fast underlag (såsom en harpiks). Peptidkæden forlænges derefter progressivt gennem en række gentagne trin, der involverer afbeskyttelse, aktivering og kobling; synteseretningen fortsætter generelt fra C-terminalen til N-terminalen. De vigtigste anvendte beskyttelsesstrategier er BOC (tert-butyloxycarbonyl) og Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) metoderne, hvor Fmoc-metoden er dukket op som den dominerende tilgang på grund af dens milde reaktionsbetingelser. Almindeligt anvendte koblingsreagenser omfatter både carbodiimid-type reagenser (f.eks. DCC) og oniumsalte (f.eks. HBTU). Efter syntese skal peptidet spaltes-typisk ved hjælp af reagenser såsom TFA eller HF for at eluere det fra harpiksunderlaget.
Udvælgelsen af en peptidsyntesemetode er betinget af længden af peptidkæden og de specifikke karakteristika af dens sekvens: fast-fasesyntese tilbyder høj effektivitet og er let modtagelig for automatisering, hvilket gør den velegnet til syntese af middellængde-aminosyrer (f.eks. ca. 30 peptider); omvendt er opløsnings--fasesyntese bedre egnet til produktion af korte peptider. Til "vanskelige" peptider-såsom sekvenser, der er tilbøjelige til at aggregere eller dem, der indeholder specialiserede aminosyrer, kan der anvendes-alternative strategier, såsom pseudoprolinmetoden eller *ortho*-hydroxybenzyl-typebeskyttelsesmetoder.